假黄皮中化学成分及其抑制滑膜成纤维细胞增殖活性研究（一）

黄皮属植物隶属于芸香科Rutaceae，假黄及其究全世界约有30种，皮中主要分布于东半球的化学滑膜热带和亚热带地区。分布于我国的成分成纤黄皮属植物约有10种以及2变种，其中1种为引进栽培种，抑制集中分布于海南、维细广西、胞增广东以及云南等南部省区。殖活黄皮属植物大多为民间药用，性研药用历史悠久，假黄及其究疗效显著，皮中具有行气止痛、化学滑膜解毒散结的成分成纤功效，常用于治疗感冒、抑制类风湿性关节炎以及胃痛等。维细现代植物化学研究表明黄皮属植物中富含香豆素类、生物碱类、木脂素类、倍半萜类、黄酮苷类、二萜类以及柠檬苦素类等多种结构类型的化合物，现代药理学研究表明黄皮属植物中分离得到的化学成分具有抗炎活性、抗肿瘤活性、抗真菌活性、抗病毒活性、神经保护活性以及保肝活性等多种生物活性。假黄皮Clausena excavata为芸香科黄皮属植物，分布于我国的海南、云南、广东、广西、福建、台湾等省区。假黄皮为民间药用植物，具有行气、止痛、驱风、去湿的功效。现代植物化学和药理活性研究表明假黄皮中富含结构类型丰富、生物活性显著的化学成分。

本课题组在前期研究中对假黄皮枝叶的90%乙醇提取物的抗类风湿性关节炎活性进行了初步评价，结果表明假黄皮枝叶的90%乙醇提取物具有显著的抗类风湿性关节炎活性。为了更合理地开发利用该药用植物资源，充分发挥其药用价值，本课题组对假黄皮枝叶的90%乙醇提取物中的化学成分进行了系统研究，从中分离得到了19个化合物，分别鉴定为：苔色酸甲酯(1)、丁香脂素(2)、lenisin A(3)、东莨菪素(4)、欧前胡素酚(5)、N-benzoyltyrarnine methyl ether(6)、N-p-coumaroyltyramine(7)、aurantiamide acetate(8)、1H-indole-3-carboxaldehyde(9)、furostifoline(10)、clausenalansine E(11)、3-formylcarbazole(12)、clausine L(13)、clausine E(14)、methyl carbazole-3-carboxyaate(15)、glycosinin(16)、murrayafoline A(17)、clausine H(18)和2, 7-dihydroxy-3-formyl-1-(3'-methyl-2'-butenyl)carbazole(19)。其中化合物1～11为首次从假黄皮中分离得到，化合物1、2、10为首次从黄皮属植物中分离得到。此外，通过对化合物1～19的体外抑制MH7A滑膜成纤维细胞增殖的活性进行评价化合物1～19的抗类风湿性关节炎活性，结果表明化合物10～19表现出了较为显著的抗类风湿性关节炎活性，它们对MH7A滑膜成纤维细胞增殖的抑制活性的IC50为(27.63±0.18)～(235.67±2.16) μmol·L^-1。

1 材料

中低压制备色谱(瑞士Buchi公司)；Agilent 1200分析型高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies有限公司)；Cosmosil C18分析型色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Cosmosil C18制备型色谱柱(20 mm×250 mm，5 μm)；Thermo Fisher UltiMate 3000制备型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Finnigan LCQ Advantange MAX 质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Bruker AV-400型超导核磁共振仪(德国Bruker公司)；Sephadex LH-20凝胶(美国Amersham Blosclences公司)；薄层硅胶GF254和柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；ODS色谱材料(C18，10～40 μm，德国Merck公司)；N-1001型旋转蒸发仪(日本EYELA公司)；YOKO-ZX紫外分析暗箱(武汉药科新技术开发有限公司)；4001N电子天平(上海民桥精密科技仪器有限公司)；OLYM PUS-IX70型生物倒置显微镜(日本Olym-pus公司)；Tecan Infinite Pro全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；BHC-1300B2型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；Thermo HERAcell 240i型CO2恒温细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；噻唑蓝(美国Sigma公司)；F12培养基、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶、胎牛血清和双抗(美国Hyclone公司)；MH7A滑膜成纤维细胞来源于美国模式培养物集存库ATCC(American type culture collection)细胞库，购自于上海冠导生物工程有限公司。其他试剂均为分析纯试剂或者色谱试剂 (西陇化工股份有限公司)。

假黄皮枝叶于2019年10月采集于云南省西双版纳傣族自治州西双版纳国家级自然保护区，经海南师范大学热带药用资源化学教育部重点实验室付艳辉研究员鉴定为芸香科黄皮属植物假黄皮C. excavata的枝叶，凭证标本(No.CLEX20191002)保存于海南师范大学海南师范大学热带药用资源化学教育部重点实验室植物标本室。

2 提取分离

将阴干的假黄皮枝叶19.8 kg粉碎后用90%乙醇冷浸提取3次，每次提取7 d，得乙醇提取总浸膏(1 113.8 g)。乙醇提取总浸膏(1 110.0 g)经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇体系为洗脱剂进行梯度洗脱(100:0～35:65)，得到8个流分Fr.1～Fr.8。Fr. 2(48.7 g)经反相ODS柱色谱分离，以甲醇-水体系为洗脱剂进行梯度洗脱(65:35～100:0)，得到6个亚流分(Fr.2A～Fr.2F)。Fr.2B(6.2 g)经硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-丙酮体系为洗脱剂进行梯度洗脱(95:5～30:70)，再经制备型HPLC(DAD检测器；检测波长为210、230、254、280 nm)制备(乙腈-水65:35)得到化合物1 (21.3 mg)、7 (54.2 mg)、12 (63.6 mg)、14 (6.3 mg)和17 (21.5 mg)；Fr.2C(5.7 g)经硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-丙酮(80:20～25:73)为洗脱剂进行梯度洗脱，再经制备型HPLC(DAD检测器；检测波长为210、230、254、280 nm)制备(甲醇-水73:27)得到化合物2 (42.1 mg)、8 (7.9 mg)、13 (8.6 mg)、16 (53.5 mg)、18 (74.1 mg)；Fr. 3(55.3 g)经反相ODS柱色谱分离，以甲醇-水体系为洗脱剂进行梯度洗脱(55:45～100:0)，得到7个亚流分(Fr.3A～Fr.3G)；Fr.3B(6.7 g)经硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-丙酮体系为洗脱剂进行梯度洗脱(85:15～20:80)，再经制备型HPLC(DAD检测器；检测波长为210、230、254、280 nm)制备(乙腈-水58:42)得到化合物3 (7.8 mg)、4 (9.3 mg)、9 (15.8 mg)、15 (87.3 mg)；Fr. 4(64.6 g)经反相ODS柱色谱分离，以甲醇-水体系为洗脱剂进行梯度洗脱(45:55～100:0)，得到6个亚流分(Fr.4A～Fr.4F)；Fr.4B (8.3 g)经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱(80:20～30:70)，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇-水70:30)纯化后再经制备型HPLC(DAD检测器；检测波长为210、230、254、280 nm)制备(甲醇-水60:40)得到化合物5 (8.7 mg)、6 (9.7 mg)、10 (31.6 mg)、11 (42.5 mg)、19 (22.3 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 白色无定型粉末，三氯化铁显色反应阳性；C9H10O4，ESI-MS m/z 183 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.78 (1H, s, 2-OH), 6.28 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-5), 6.23 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-3), 3.91 (3H, s, 7-OCH3), 2.47 (3H, s, 6-CH3)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 172.3 (C-7), 165.5 (C-2), 160.9 (C-4), 144.0 (C-6), 111.6 (C-5), 105.6 (C-1), 101.4 (C-3), 52.0 (7-OCH3), 24.4 (6-CH3)。以上数据与文献中报道的苔色酸甲酯的波谱数据基本一致，故鉴定化合物1为苔色酸甲酯。

化合物2 白色无定型粉末，三氯化铁显色反应阳性；C22H26O8，ESI-MS m/z 419 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 5.59 (1H, s, H-10, 14, 16, 20), 4.72 (1H, d, J = 4.2 Hz, H-2), 4.28 (1H, dd, J = 9.0, 7.2 Hz, H-4β, 8β), 3.91 (1H, dd, J = 9.0, 3.6 Hz, H-4α, 8α), 3.89 (3H, s, 11, 13, 17, 19-OCH3), 3.10 (1H, m, H-5)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 147.3 (C-11, 13, 17, 19), 134.4 (C-12, 18), 132.2 (C-9, 15), 102.8 (C-10, 14, 16, 20), 86.2 (C-2, 7), 71.9 (C-4, 8), 56.5 (11, 13, 17, 19-OCH3), 54.4 (C-1)。以上数据与文献中报道的丁香脂素的波谱数据基本一致，故鉴定化合物2为丁香脂素。

化合物3 白色无定型粉末；C16H24O5, ESI-MS m/z 297 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 6.41 (2H, s, H-2, 6), 5.94 (1H, m, H-8), 5.10 (2H, m, H-9), 4.41 (1H, dd, J = 10.6, 2.5 Hz, H-1'α), 3.86 (1H, dd, 10.6, 8.2 Hz, H-1'β) 3.63 (1H, dd, J = 8.2, 2.5 Hz, H-2'), 3.85 (6H, s, 3, 5-OCH3), 3.33 (2H, d, J = 6.8 Hz, H-7), 1.25(3H, s, H-5'), 1.25 (3H, s, H-4')；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 152.9 (C-3, 5), 137.1 (C-1), 136.4 (C-8), 135.3 (C-4), 116.3 (C-9), 105.5 (C-2, 6), 75.9 (C-2'), 75.7 (C-1'), 71.5 (C-3'), 56.2 (3, 5-OCH3), 40.7 (C-7), 26.9 (C-5'), 25.1 (C-4')。以上数据与文献中报道的lenisin A的波谱数据基本一致，故鉴定化合物3为lenisin A。

化合物4 淡黄色无定形粉末，异羟肟酸铁显色反应阳性；C10H8O4, ESI-MS m/z 193 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.60 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-4), 6.91 (1H, s, H-8), 6.84 (1H, s, H-5), 6.26 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 3.95 (3H, s, 6-OCH3)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 161.5 (C-2), 150.3 (C-6), 149.7 (C-9), 144.0 (C-7), 143.3 (C-4), 113.4 (C-3), 111.5 (C-10), 107.5 (C-5), 103.2 (C-8), 56.4 (6-OCH3)。以上数据与文献中报道的东莨菪素的波谱数据基本一致，故鉴定化合物4为东莨菪素。

化合物5 淡黄色无定形粉末，异羟肟酸铁显色反应阳性；C14H14O3, ESI-MS m/z 231 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.63 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-4), 7.22 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5), 6.81 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-6), 6.24 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 5.28 (1H, dd, J = 7.2, 5.7 Hz, H-2'), 3.61 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-1'), 1.85 (3H, s, H-4'), 1.75 (3H, s, H-5')；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 161.9 (C-2), 158.5 (C-7), 153.3 (C-9), 144.3 (C-4), 136.0 (C-3'), 126.7 (C-5), 120.5 (C-2'), 115.0 (C-8), 113.3 (C-3), 112.9 (C-10), 112.6 (C-6), 26.0 (C-4'), 22.2 (C-1'), 18.1 (C-5')。以上数据与文献报道的欧前胡素酚的波谱数据基本一致，故鉴定化合物5为欧前胡素酚。

化合物6 白色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C16H17NO2, ESI-MS m/z 256 +；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 8.54 (1H, br t, NH), 7.81 (2H, m, H-2, 6), 7.50 (1H, m, H-4), 7.45 (2H, m, H-3, 5), 7.15 (2H, d, J = 8.6, H-2', 6'), 6.86(2H, d, J = 8.6, H-3', 5'), 3.71 (3H, s, 4'-OCH3), 3.45 (2H, t, J = 7.0, H-8'), 2.77 (2H, t, J = 7.0, H-7')；13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 166.2 (C-7), 157.8 (C-4'), 134.7 (C-1), 131.5 (C-4), 131.2 (C-1'), 129.7 (C-2, 6), 128.4 (C-3, 5), 127.2 (C-2', 6'), 113.9 (C-3', 5'), 55.1 (4'-OCH3), 41.2 (C-8'), 34.3 (C-7')。以上数据与文献报道的N-benzoyltyrarnine methyl ether的波谱数据基本一致，故鉴定化合物6为N-benzoyltyrarnine methyl ether。

化合物7 白色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C17H17NO3, ESI-MS m/z 284 +；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 7.37 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-2', 6'), 7.29 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-β), 7.00 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2'', 6''), 6.67 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3'', 5''), 6.77 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-3', 5'), 6.38 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-α), 3.30 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 2.63 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-l)；13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 165.6 (C=O), 159.0 (C-4''), 155.7 (C-4'), 138.9 (C-β), 129.7 (C-2', 6'), 129.7 (C-1'), 129.4 (C-2'', 6''), 126.0 (C-1''), 118.7 (C-α), 115.9 (C-3', 5'), 115.3 (C-3'', 5''), 40.9 (C-1), 34.5 (C-2)。以上数据与文献报道的N-p-coumaroyltyramine的波谱数据基本一致，故鉴定化合物7为N-p-coumaroyltyramine。

化合物8 白色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C27H30N2O4, ESI-MS m/z 447 +；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.72 (2H, m, H-3', 7'), 7.52 (1 H, m, H-5'), 7.44 (2H, m, H-4', 6'), 7.31 (2H, m, H-19), 7.29 (1H, m, H-17), 7.27 (2H, m, H-18), 7.26 (2H, m, H-16), 7.24 (2H, m, H-15), 7.17 (1H, m, H-10), 7.14 (2H, m, H-8, 12), 7.06 (2H, m, H-9, 11), 6.81 (1H, d, J = 7.7 Hz, 1-NH), 6.07 (1 H, d, J = 8.6 Hz, 4-NH), 4.78 (1H, d, J = 8.1, 5.9 Hz, H-2), 4.34 (1H, d, J = 8.1, 5.9 Hz, H-5), 3.82 (1H, dd, J = 11.3, 4.2 Hz, H-20), 3.93 (1H, dd, J = 11.3, 4.9 Hz, H-20), 3.06 (1H, dd, J = 13.7, 8.3 Hz, H-13), 3.21 (1H, dd, J = 13.7, 5.9 Hz, H-13), 2.76 (2H, m, H-6), 2.02 (3H, s, H-2'')；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.9 (C-1''), 170.4 (C-3), 167.3 (C-1'), 136.8 (C-7), 136.7 (C-14), 133.8 (C-2'), 132.1 (C-5'), 129.4 (C-16, 18), 129.3 (C-9, 11), 129.0 (C-15), 128.9 (C-4', 6'), 128.8 (C-8), 128.6 (C-19), 127.3 (C-13), 127.2 (C-3', C-7'), 126.9 (C-10), 64.7 (C-20), 55.1 (C-2), 49.6 (C-5), 38.6 (C-13), 37.6 (C-6), 20.94 (C-2'')。以上数据与文献报道的aurantiamide acetate的波谱数据基本一致，故鉴定化合物8为aurantiamide acetate。

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